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一、基本原理

1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開(kāi)始用于抗原定位的酶標抗體技術(shù)發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的測定方法。

這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時(shí)，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據顏色反應的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

二、方法類(lèi)型和操作步驟

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：

①固相的抗原或抗體；

②酶標記的抗原或抗體；

③酶作用的底物；

根據試劑的來(lái)源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類(lèi)型的檢測方法。

（一）應用親和素和生物素的ELISA

此方法是目前國內主流ELISA試劑盒廠(chǎng)商最常用的方法，有廠(chǎng)商稱(chēng)之為雙抗夾心法，但與真正的“雙抗夾心法”卻有著(zhù)很大區別。

親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結合?，F在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱(chēng)維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類(lèi)和酶等多種類(lèi)型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經(jīng)結合就極為穩定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類(lèi)似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來(lái)，就能大幅提高ELISA的信號強度。

親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應放大?？梢栽诠滔嗌舷阮A包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過(guò)親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗原固相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素-酶結合物，以放大反應信號。橋聯(lián)法ABC-ELISA（avidin biotin complex-ELISA）夾心法測抗原的過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1、親和素-生物素系統ELISA

（二）競爭法

競爭法（圖2-1）可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無(wú)抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會(huì )與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會(huì )，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。

（3）加底物顯色：參考管中由于結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。

圖2-1、競爭法測抗原示意圖

（三）雙抗體夾心法

部分廠(chǎng)家習慣性把雙抗夾心法做出來(lái)的產(chǎn)品稱(chēng)之為“一步法” “減步法” “one step” “quick” 等五花八門(mén)的名頭，但其真正操作步驟與雙位點(diǎn)一步法在操作上有很大區別。

雙抗體夾心法（圖3）是檢測抗原比較常用的方法，操作步驟如下：

圖3、雙抗體夾心法測抗原示意圖

（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質(zhì)。

（2）加受檢樣本：使之與固相抗體接觸反應一段時(shí)間，讓樣本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質(zhì)。

（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據顏色反應的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

（四）雙位點(diǎn)一步法

在雙抗體夾心法測定抗原時(shí)，如應用針對抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時(shí)可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步（圖2）。這種雙位點(diǎn)一步不但簡(jiǎn)化了操作，縮短了反應時(shí)間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著(zhù)提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

圖4、雙位點(diǎn)一步法示意圖

在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類(lèi)同于沉淀反應中抗原過(guò)剩的后帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應嚴重時(shí)甚至可出現假陰性結果。

（五）間接法測抗體

間接法（圖5）是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。操作步驟如下：

（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質(zhì)。

（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結合，在洗滌過(guò)程中被洗去。

（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。

（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

本法只要更換不同的固相抗原，可以用同一種酶標抗體 檢測各種與抗原相應的目標待檢抗體。

圖5、間接法測抗體示意圖

（六）捕獲法測IgM抗體

捕獲包被法（亦稱(chēng)反向間接法）ELISA，首要用于血清中某種抗體亞型成分（如 IgM）的測定。以目前常用的 IgM 測定為例，因血清中針對某種抗原的特異性 IgM 和 IgG 同時(shí)存在，而IgG可干擾 IgM 的測定。因此先將一切血清 IgM（包括異性 IgM 和非特異性 IgM）固定在固相上，在去除 IgG 后再測定特異性 IgM。IgM 抗體的檢測用于流行癥的前期確診中。先用抗人 IgM 抗體包被固相，以捕獲血清標本中的 IgM（其間包括針對抗原的特異性 IgM 抗體和非特異性的 IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性 IgM 相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的 IgM 成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的前期確診。類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）相同能攪擾捕獲包被法測定 IgM 抗體，導致假陽(yáng)性反響。因此中和 IgG 的間接法近來(lái)頗受喜愛(ài)，用這類(lèi)試劑檢測抗 CMV IgGM 和抗弓形蟲(chóng) IgM 抗體已獲成功。操作步驟如下：

圖6、捕獲法測IgM抗體示意圖

（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。

（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。

（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。

（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽(yáng)性反應。

ELISA的技術(shù)要點(diǎn)

ELISA的技術(shù)要點(diǎn)包括三個(gè)方面：試劑的制備、反應條件的選擇和操作的標準化。

一、試劑的制備

ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體和與標記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。

（一）固相載體

可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來(lái)的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在ELISA測定過(guò)程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應。加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應的容器，最后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過(guò)程中使圓珠滾動(dòng)淋洗，效果更好。最常用的載體為微量反應板，專(zhuān)用于ELISA測定的產(chǎn)品也稱(chēng)為ELISA板，國際通用的標準板形是8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結果?，F在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量反應板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內加入適當稀釋的酶標抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各讀數在0.8左右。計算所有讀數的平均值。所有單個(gè)讀數與平均讀數之差應小于10％。與聚苯乙烯類(lèi)似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時(shí)也略高。為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗：用其它免疫學(xué)測定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標本和一個(gè)典型的陰性標本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較測定結果。在哪一種載體上陽(yáng)性結果與陰性結果判別最大，這種載體就是這一ELISA測定的最合適的固相載體。除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類(lèi)測定形式將在“膜載體的酶免疫測定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應時(shí)固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應的速率，反應結束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。