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聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)是在體外酶促擴增特定DNA片段的技術,由美國Kary Mullis及其同事于1985年發(fā)明。熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶的應用和自動化裝置的發(fā)明與完善,使PCR技術進入實用階段。該技術的發(fā)明和廣泛應用,大大推動了分子生物學各相關學科的發(fā)展,發(fā)明者也因此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。
隨著PCR技術的成熟,派生了不少相關技術。這類技術具有敏感、特異、快速和簡單等優(yōu)勢,在微生物檢驗中的應用越來越廣,不少國家將其納入檢驗的標準方法;我國檢驗檢疫領域對其應用也日益擴大,國家要求市級以上疾病預防控制中心具有PCR檢測技術能力,用于突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢測和食品安全的有效監(jiān)管等。
PCR技術的基本原理和DNA在體內天然復制過程相似,是在體外重復進行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結合、DNA聚合酶催化形成新DNA鏈的過程,只是整個過程在體外進行,而且反應體系比體內更簡單。
1.體系組成和基本過程
(1)體系組成經典PCR以DNA為模板,體系組成包括原始模板、引物、原料、DNA聚合酶以及合適的鹽、緩沖液以及溫度循環(huán)參數等。原始模板是指長的雙鏈DNA待擴增目的片段,微生物檢驗中往往是待測標本中的DNA。引物是兩段單鏈寡核苷酸,其序列與待擴增片段的兩端分別相同和互補。原料則是4種脫氧核苷三磷酸。
(2)基本過程PCR基本過程分為變性、退火和延伸三個階段,經過多次循環(huán)實現目的片段的擴增。變性是指將反應體系混合物加熱至93℃~95℃,維持較短的時間,一般30s,使待測的雙鏈DNA在高溫作用下變性,解鏈為2條單鏈DNA模板的過程。退火是指將反應體系混合物冷卻至特定溫度(也稱退火溫度)。延伸是指將反應體系的溫度提高到72℃,在耐熱DNA聚合酶作用下,以4種脫氧核苷三磷酸為原料,按堿基配對原則,合成與兩條模板DNA互補的2條新的DNA鏈。
2.PCR技術的特點PCR技術顯著的特點,決定了其無論在生物學相關領域的研究,還是在微生物檢驗方面,都具有很重要的地位。
(1)高靈敏度:產物量以指數方式增加,能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=10-6)水平,能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞等等。
(2)高特異性:以堿基配對原則使引物與模板DNA特異正確的結合、DNA聚合酶合成反應具有高度的忠實性、靶基因DNA具有高度特異性和保守性。
(3)方法簡便和快速:一次性加好反應液,于DNA擴增儀進行變性-退火-延伸,2~4h完成擴增反應;而且擴增產物易分析、無放射性污染、易推廣。特別是實時熒光定量PCR的發(fā)明和推廣,可以通過電腦實時監(jiān)控反應進程,不需要再對產物進行檢測,大大縮短了實驗時間。
(4)對樣本的純度要求低及適用范圍廣:PCR技術對樣本的純度要求低,DNA粗制品可作為擴增模板;不一定需要分離病毒、細菌或培養(yǎng)細胞;可直接用臨床血液、體腔液、洗漱液、毛發(fā)、細胞、活組織等樣本的粗制DNA擴增檢測。適用范圍非常廣泛,不僅適合于微生物的快速檢測,還可用于臨床和法醫(yī)等各方面。
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變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA。
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退火:(60℃-65℃):系統(tǒng)溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。
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延伸:(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP為原料,從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸,合成與模板互補的DNA鏈。
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如下圖所示,在經歷一次變性退火延伸的流程之后,原本只有1條的DNA雙鏈變成了2條;2次之后是4條;以此類推,只要經歷幾十個循環(huán)數,就能產生大量的相同DNA片段。
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PCR實驗流程示意
以上就是常規(guī)PCR的正常流程。那在擴增完成之后我們需要對擴增出來的DNA進行檢測,常規(guī)的PCR技術通常只能借助凝膠電泳手段。這里不對電泳技術做過多介紹,其是根據DNA的分子量大小不同對DNA進行分離,從而進行鑒定以及純化DNA的技術。借助凝膠電泳可以判斷擴增出來的DNA片段條帶大小是否與目的條帶大小一致,從而知道是否得到了想要的產物;看是否有雜帶,判斷擴增是否具有特異性;看是否有引物二聚體判斷引物的設計好壞等等。
很多人誤以為RT-PCR是Real-time PCR的縮寫,因此將二者混為一談,但實際上是不一樣的。
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其實 Real-time-PCR 和 qPCR(Quantitative Rea-time-PCR)是一碼事,都是實時定量 PCR,指的是PCR 過程中每個循環(huán)都有數據的實時記錄,因此可以對起始模板數量進行精確的分析。
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雖然 Real-time PCR(實時熒光定量 PCR)和 Reverse transcription PCR(反轉錄PCR)看起來都可以縮寫為 RT-PCR,但是,國際上的約定俗成的是:RT-PCR 特指反轉錄 PCR,而 Real-time PCR一般縮寫為 qPCR(quantitative real-time PCR)。在剛才介紹PCR后續(xù)檢測方法的時候,我們說了通常只能借助凝膠電泳去分析產物,但實時熒光定量PCR借助熒光化學物質讓我們在PCR的過程當中就可以檢測到DNA的擴增情況,從而不需要再去跑電泳了,極大的簡化了操作者的實驗步驟。
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簡單來講,qPCR就是在整個擴增的過程中,引入了熒光基團,隨著DNA數量的成倍增加,反應體系中的熒光信號也會增強。借助對熒光信號的強弱進行檢測,從而對DNA擴增的情況進行定量分析。
目前根據不同的熒光物質,我們可以大致將qPCR分為兩種。一種是用熒光染料,主要為SYBRGreenⅠ染料,該染料能與DNA雙鏈結合,結合之后會顯示熒光信號,而在沒有結合的時候幾乎檢測不到熒光信號,隨著拷貝數的增加,熒光信號增強。而還有一種是使用熒光探針,又叫TaqMan探針法,其原理是根據目的基因設計一個能與之特異性結合的熒光探針,該探針包含兩個基團:一個熒光基團和一個淬滅基團,正常情況下因為淬滅基團的存在導致熒光基團無法發(fā)出熒光,而在擴增時探針結合到DNA的模板上,并且擴增到探針位置時兩個基團被切開,從而熒光基團可以發(fā)出熒光,同樣隨著拷貝數的增加,熒光信號增強。
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借助這種定量關系,人們可以繪制出PCR的擴增曲線,該曲線是熒光信號隨著循環(huán)數變化而變化的曲線,借助該曲線就可以對PCR的情況進行分析,理想的曲線應該是呈現“S”型的增長,但是關于曲線分析的內容比較復雜,在這里暫時不做過多贅述。至少我們知道借助該技術我們可以不用在每次做完PCR之后去辛苦的跑電泳,也可以更精確的分析我們的PCR結果。因此該技術被越來越廣泛的應用。
另外值得一提的是,在疫情當下,我們在做完核酸采樣之后到底如何去判定被檢者的陰性還是陽性,使用的便是qPCR技術,倘若在經過擴增一定循環(huán)數之后能檢測到熒光信號,我們可認為被檢者為陽性,反之則陰。
RT-PCR 就是逆轉錄 PCR(reverse transcription PCR)或者稱反轉錄 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在 RT-PCR 中,一條 RNA鏈被逆轉錄成為互補 DNA,再以此為模板通過 PCR 進行 DNA 擴增。首先我們要清楚什么是反轉錄,我們一般將遺傳信息從DNA流向RNA的過程稱為轉錄,反之,以RNA為模板合成DNA的過程我們稱為反轉錄。該技術的一般過程為,首先以RNA為模板在反轉錄酶的作用下合成其對應cDNA,再以cDNA為模板進行普通的PCR過程。歸根結底,其就是在PCR過程前加了一個反轉錄過程,那在這之后我們既可以用普通PCR手段,也可以采用qPCR進行擴增。比如病毒通常是以RNA為遺傳物質,我們在進行病原體檢測的時候只能提取到它的RNA,所以是需要進行反轉錄的。
其實除了以上介紹的幾種PCR之外,現在還有數字PCR技術,也叫核酸分子絕對定量技術,相比于熒光定量,該技術更是對DNA數的絕對定量;以及巢式PCR等等。但其本質都離不開最開始說的PCR的三個步驟。
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