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常見(jiàn)小鼠采血方法
小鼠是科研實(shí)驗中常用的實(shí)驗動(dòng)物,但由于其體積小,血管細,采血難度大,進(jìn)而影響采血的質(zhì)量。
ELK簡(jiǎn)要總結了常見(jiàn)的小鼠采血方法,僅供參考:
一只成年小鼠的循環(huán)血量大約是1.5~2.5ml,大約體重的 6~8%。在對營(yíng)養狀況良好的小鼠進(jìn)行采血時(shí),單次采血量最多可以到達循環(huán)血量的10%,(例:若20克小鼠,它的總血量約占1.2-1.4毫升,即每次取120ul-140ul血液不會(huì )對小鼠有太大的影響)。采血之后應該給予溫熱的等滲溶液補充,可以在2~3個(gè)星期內恢復原有的水平。兩周采血量小于血液循環(huán)的10%,單周小于7.5%,小鼠血液循環(huán)72ml/kg
實(shí)驗室常用抗凝劑:乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、枸櫞酸鹽、草酸鹽、肝素
實(shí)驗室常用采血管:(采血后立即顛倒混勻8次)
1.黑色:枸櫞酸鈉;血沉
2.淺藍色:枸櫞酸鈉;血凝試驗(如PT、APTT)
3.深藍色:肝素鈉或EDTA-Na2;血液微量元素
4.紫色:EDTA-K2;血常規(血液細胞分析)
5.綠色:肝素鋰;大部分生化、血氨
6.灰色:血糖降解抑制劑和EDTA-Na2;血糖
7.棕色:肝素鈉或EDTA-K2;血鉛
8.淺黃色ACD管:葡萄糖、抗凝劑;血庫試驗
9.淺黃色SPS管:SPS液、氯化鈉溶液;血液培養、微生物培養
尾尖采血
麻醉小鼠后,用溫水(但水溫不要過(guò)高)擦拭尾巴,引起輕微的血管擴張。
用無(wú)菌手術(shù)刀、刀片或鋒利的剪刀,快速截斷小鼠尾尖0.5-1cm。如果需要多次采血,之后每次僅需截除2-3mm。
可以從尾部向尾尖方向按摩,以增加血流(但是,這會(huì )降低血樣的質(zhì)量,增加溶血的風(fēng)險)。也可以用毛細采血管收集血液,或直接滴入收集管中。采血結束后,按壓傷口或使用止血劑(如硝酸銀,6%液體火棉膠)來(lái)止血。每次采血量大約可達0.1ml。
眼眶靜脈叢采血
優(yōu)點(diǎn):眼眶后靜脈叢采血法方法簡(jiǎn)單,便于掌握。血流較快,采血量多,能在較短時(shí)間內采約0.5mL血。傷口較小,愈合較快。成功率高,死亡率低。
缺點(diǎn):不能避免組織液的混入,對于血樣要求較高的研究應謹慎使用。
小鼠經(jīng)氣體麻醉后,左手拇指及食指壓迫小鼠的頸部?jì)蓚?,阻礙靜脈回流,使眼球充分外突,提示眼眶后靜脈叢充血。也可以將小鼠放置在側臥位,拇指與食指分別置于小鼠頭頂和下頜,將皮膚向后及向下拉。抓握時(shí)要避免對氣管施壓,否則可能會(huì )影響小鼠呼吸。
將毛細采血管(建議采用0.5*100mm規格的毛細管,在使用前折成小段,每段大約3-4cm)置于內側眼角處,并且以與鼻翼平面成30-45度沿內眥插入內眼角,滑入眼球后方,輕輕向眼底方向刺入。
當感到有阻力時(shí)即輕輕旋轉采血管的同時(shí)施加壓力以切開(kāi)靜脈叢,血液將通過(guò)毛細作用流入采血管。不能刺地過(guò)深,一般2-3mm即可。
采血結束后,立即松開(kāi)手指對小鼠的壓迫,使眼球復位,同時(shí)將采血器拔出??捎酶擅耷驂鹤⊙劭?,確保止血。一般眼眶靜脈叢采血量可以達到0.2-0.3ml。
頜下靜脈采血
綁定小鼠,可將小鼠側臥,使小鼠頭部盡量固定。在小鼠嘴角沿線(xiàn)與外眼角線(xiàn)橡膠處找到頜下靜脈的大致位置,會(huì )發(fā)現一個(gè)無(wú)毛的小點(diǎn),有點(diǎn)像酒窩,基本位于嘴角遠端稍低于下巴線(xiàn)。
針保持垂直于皮膚表面,刺入皮膚。深度不超過(guò)針頭的斜面(約3mm)。拔出針頭后,血液就會(huì )流出。為方便采血,可使小鼠頭部低于心臟高度。采血結束后,按壓以止血。一般采血量為0.2-0.5ml。
隱靜脈采血(總量5%)
將小鼠置于固定管或架中,但保持后腿可自由活動(dòng),剃除跗部的毛。為使膝蓋與踝關(guān)節之間的隱靜脈更加明顯,可以在后腿膝蓋以上使用止血帶。在近尾側的皮膚表面可以找到隱靜脈。
針垂直于皮膚表面扎破血管。不要進(jìn)針過(guò)深,以免刺穿肌肉或碰到骨頭。血液會(huì )從入針處慢慢流出,用毛細采血管收集,并松開(kāi)止血帶。采血結束后,按壓傷口或使用止血劑(如硝酸銀)以止血,并將小鼠放回籠內。
舌下靜脈采血
將小鼠麻醉后仰臥于實(shí)驗臺面上并固定。用眼科彎鑷將小鼠舌頭拉出,可明顯看到小鼠舌下靜脈。
持采血針與舌面呈10°夾角插入舌下靜脈,見(jiàn)有回血緩慢抽取,直至采到所需血量。
頸靜脈采血
該方法采血量( 0.2 ml至近全血量) 及采血次數( 1~8次/d) 可隨分析目的而變動(dòng),適用于人手少、動(dòng)物數量多、實(shí)驗時(shí)間緊以及藥代動(dòng)力學(xué)等需連續少量取血的研究中。但要求技術(shù)熟練, 方能得心應手。在一定時(shí)間內, 如果采血量和采血次數增加, 會(huì )使動(dòng)物引起一定的應激性反應或采血部位的傷害。
將動(dòng)物胸前區采血部位皮膚消毒, 于胸前正中線(xiàn)約第四肋骨水平先用注射器針頭沿水平方向刺入皮膚。
再向頸靜脈所在位置沿皮下進(jìn)針, 針頭到達頸靜脈所在位置時(shí), 輕引注射器內筒使之呈負壓, 再使注射器與胸部表面成30°~ 40°角向頸靜脈刺入, 此時(shí)注射器應與頸靜脈走行方向相一致。
在刺入過(guò)程中, 速度要緩慢, 刺入的深度約5 mm, 在試探性緩慢刺入或拔出時(shí), 如有血液自動(dòng)流入注射器內筒, 說(shuō)明針尖已在頸靜脈內, 此時(shí)固定好動(dòng)物, 勿使注射器針頭移動(dòng)。
也可將采血針抵在動(dòng)物胸骨上以便于操作, 小心抽引注射器內筒, 待血液足夠時(shí), 拔出采血針, 用干棉球按壓止血。
尾靜脈采血
一個(gè)人可以用微型手電筒或LED小夜燈等緊貼尾靜脈,在燈光的照射下,尾靜脈會(huì )被很清晰的顯示,提高成功率。
固定器(自行設計)小鼠,將尾巴拉直,用酒精棉球擦拭尾巴或者用熱水或者熱毛巾焐熱尾巴(熱水浸泡鼠尾), 使尾部靜脈擴張。
用左邊手的食指,中指,無(wú)名指及大拇指將小鼠尾巴固定。
握住1ml 注射器(選用29G的針頭為宜)前面0.1ml處,右手小指搭在拽著(zhù)鼠尾的左手拇指處斜15°角緩慢進(jìn)針(鼠尾遠端約1/3的位置)。適當增加內壓看有無(wú)回血,若有回血則緩慢抽取所需血量,棉簽按壓止血。
頜下靜脈采血
將小鼠麻醉后,平躺放置在實(shí)驗臺面上,中指、食指固定小鼠尾部。
用刀片輕劃小鼠尾側靜脈或尾正中動(dòng)脈。待血液流出后,用移液槍吸取血液。取血完畢后,棉簽按壓止血。
腹主動(dòng)脈采血
優(yōu)點(diǎn):采血法取血量大、不易溶血,血液質(zhì)量較好,適用于多項目檢測,且不損傷器官,有利于病理組織學(xué)檢查。
缺點(diǎn):操作比較復雜,應注意掌握適當的麻醉深度,防止心跳驟停,同時(shí)防止大鼠躁動(dòng)。本方法造成的出血速度快,易造成出血性的心臟停跳,故要防止采血過(guò)程中出血。且本方法采血過(guò)程中如多次采血不宜拔出針頭。
將大鼠腹腔注射麻醉劑后,直到身體全身變軟,把大鼠仰臥固定在手術(shù)臺上,背部可以放置—粗試管以充分暴露腹主動(dòng)脈。
常規消毒后用手術(shù)剪刀沿腹正中線(xiàn)剪開(kāi)腹腔,用小鑷子輕輕扒開(kāi)血管周?chē)?,再用棉球把覆蓋在血管的多余脂肪擦干凈,直到清晰看清血管為止(用棉球可以盡量減少小血管破裂出血,影響接下來(lái)進(jìn)針時(shí)的視線(xiàn))。
找腹主動(dòng)脈(粉)在脊柱上面,腹腔靜脈血管(比腹主動(dòng)脈粗,黑)旁,找到后,術(shù)者先固定血管,盡可避免血管移位,左手拇指和食指固定住血管兩旁的脂肪及其它臟器,無(wú)名指按住血管進(jìn)針點(diǎn)的上端,降低血壓,可以避免血液濺出。
右手持穿刺針,針尖斜面朝下,入針角度約(小于)30度左右,朝向心端方向刺入,深度以5m左右為宜,進(jìn)針后可以用止血夾夾住針頭,可以避免麻醉不夠掙扎導致血管被針頭戳破。
取完血后,用棉球輕壓針眼處,快速拔出針頭,可以反復采集多管的血樣進(jìn)行不同項目的測試(一般體重200~300g大鼠可采血液8~10mL)。
心臟采血(非必需勿用)
優(yōu)點(diǎn):取血快,血液不易凝集,心區面積大,進(jìn)針準確性較高,可一針見(jiàn)血,且采血量能滿(mǎn)足大量試驗需要。
缺點(diǎn):采血成功率較小,死亡率高,心臟損傷較大,難以迅速愈合,不利于短期連續采血,亦無(wú)法確定是靜脈血還是動(dòng)脈血。
一般有3種心臟采血的姿勢:1、托起小鼠軀干使身體垂直與地面。身體直立以防止心臟的偏轉或胸部的扭曲。使用1毫升注射器和22g針頭。將針頭從胸部中央向下5mm處插入,深度5-10mm,將注射器與胸部保持25-30度;2、使小鼠仰臥固定,剪去胸前區被毛,皮膚消毒后,用左手食指在左側第3~4肋間觸摸到心搏處,右手持帶有4~5號針頭的注射器,選擇心搏最強處穿刺;3、使小鼠側臥,垂直于胸壁插入針頭。
如果血液沒(méi)有立刻進(jìn)入注射器,可以輕輕抽空針管,產(chǎn)生一個(gè)真空區。
當注射器中出現血液時(shí),將針管保持靜止并輕輕地抽拉活塞芯桿,以獲得更多的血液。一般可以采到0.8-1.0ml血液。
摘除眼球采血
用左手拇指、食指和中指抓取小鼠的頸部頭皮,小指和無(wú)名指固定尾巴,輕壓需要摘取的眼部皮膚,使眼球充血突出。
用眼科剪剪去小鼠的胡須,防止血從胡須處順流而下引起溶血。
用眼科彎鑷夾取眼球并快速摘取,并使血液從眼眶內流入0.5mlEP管中。待小鼠取血完畢后,斷頸處死。
斷頭采血
用左手拇指和食指以背部較緊的捏住小鼠頸部皮膚,并作小鼠頭部朝下的姿勢。
右手用剪刀猛剪鼠頸,約1/2-4/5的頸部剪斷,讓血滴入容器中。
全血、血漿、血清的區別
全血包括血細胞和血漿的所有成分。采集全血時(shí),收集管中必須含有抗凝劑。常用的抗凝劑有:肝素、檸檬酸鈉和乙二胺乙酸酸 (EDTA)。根據不同研究需要進(jìn)行選擇。
血漿是全血經(jīng)抗凝處理后,通過(guò)離心沉淀,獲得的不含細胞成分的液體。含有纖維蛋白原、凝血因子等。
血清是全血未經(jīng)過(guò)抗凝處理,血凝塊聚縮釋出的液體。其中沒(méi)有纖維蛋白原和凝血因子。
分離血漿和血清的一般方法是:2200-2500rpm 離心至少15分鐘。
正常的血清或者血漿樣本為黃色清液,而若為偏紅,即為有紅細胞破裂而產(chǎn)生溶血現象。避免溶血應注意以下的事項:
1.采血時(shí)要避免小鼠毛發(fā)、油脂沾染血液導致溶血,所用的容器、注射器必須清潔干燥,不能有水或者有機溶劑。
2.抽血時(shí)速度不要太快,速度太快會(huì )有氣泡產(chǎn)生。如果使用止血帶時(shí),止血帶不要扎的太久。
3. 抽出的血放入試管時(shí),要先拔掉針頭再放血,同時(shí)速度不要太快。
4. 收集分離血清的全血時(shí)應盡量使血液直接進(jìn)入小管底部,避免管壁或管蓋上的血液在離心過(guò)程中導致溶血
樣本出現溶血還可以用ELISA方法檢測嗎?
血樣采集操作失誤、強力震蕩和多次凍融都有可能引起溶血發(fā)生。
在ELISA檢測中,若樣本溶血輕微(淺紅色),仍可做ELISA檢測,建議適當增加洗板次數,減少背景過(guò)高影響;若溶血嚴重(深紅色),建議重新取樣。
樣本溶血可能會(huì )引起ELISA檢測OD值升高、結果假陽(yáng)性。
原因可能是樣本中游離的血紅蛋白非特異性吸附在酶標板上,血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有類(lèi)似過(guò)氧化物酶的活性,其作用類(lèi)似于辣根過(guò)氧化物酶,進(jìn)而催化底物的反應以增加樣品的OD值并引起假陽(yáng)性。
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