技術(shù)專(zhuān)欄
ELK Biotechnology總結Elisa實(shí)驗中細胞樣本的制備與保存
供稿：市場(chǎng)部
發(fā)布時(shí)間：2022-12-13
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細胞培養上清
?、賹⒓毎囵B上清液吸入離心管中，在2-8℃下以1000×g離心20分鐘，除去細胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，
?、跇颖颈４嬖?20℃或-80℃，避免反復凍融。
01 uniprot
Q:那什么情況下需要測細胞裂解液，什么情況下是檢測細胞培養液上清呢？
A:首先從細胞培養的形態(tài)（貼壁細胞、懸浮細胞）所檢測蛋白分泌表達位置：
在uniprot蛋白數據庫中Subcellular Location 欄目可查到該蛋白的分泌表達部位
例1：mouse 白介素6的分泌表達位置，細胞質(zhì)，質(zhì)膜，胞外表達。
一般采用0.05mol/LTris-HCl,pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶(hù)可根據樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。
1、細胞沉淀的收集：
①懸浮細胞:對于懸浮培養的細胞，直接通過(guò)離心收集細胞沉淀，將培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。
②貼壁細胞:對于貼壁培養的細胞，用胰酶將細胞消化下來(lái)，或用細胞刮將細胞刮下來(lái)，將培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。
我們一般建議客戶(hù)，細胞密度不要小于106個(gè)/ml。
2、細胞沉淀的洗滌：
在細胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS（等滲），輕輕顛倒混勻，將培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。重復上述操作反復洗滌1～2次。
手工勻漿，超聲破碎,裂解液裂解,反復凍融。
①手工勻漿：在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，用移液器將細胞懸浮液移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水混合物中，手動(dòng)勻漿3分鐘，然后取破碎好的細胞懸浮液進(jìn)行測定。
②超聲破碎:
在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，在冰水浴條件下進(jìn)行如下操作:
a、用超聲粉碎機進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次。
b、用超聲細胞破碎儀，300W功率，每次超聲3～5秒，間隔30秒，重復4～5次。
③裂解液裂解
常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的，或者說(shuō)作用力量強弱不同。
1、SDS屬于離子型去垢劑，效果最強，基本可以把細胞核膜破壞掉，DNA會(huì )釋放出來(lái)，裂解液變得很粘稠。
2、NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱，結合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。
3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40，也是常用的細胞裂解液成分之一，在保護蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會(huì )使蛋白變性失活）。
去垢劑屬性只是一方面，buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素
由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對酶活力的測定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進(jìn)行裂解。
④反復凍融:
在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬(wàn)個(gè)/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，放低溫冰箱中結冰，溶解，再結冰，再溶解，反復3次左右）。由于反復凍融對酶活力影響較大，一般使用生化法測酶活時(shí)不能使用。
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